01#

常見的細胞轉染方法包括化學法、物理法和病毒載體法^[1]。

化學法包括脂質體轉染法、DEAE-葡聚糖法、陽離子聚合物轉染法等。其原理是利用轉染試劑（如陽離子脂質體、DEAE-葡聚糖、陽離子聚合物等）與帶負電荷的核酸形成復合物，并通過內吞作用進入細胞，從而實現細胞轉染。化學轉染法具有操作簡便、適用范圍廣等優點，但也存在一定的細胞毒性^[2-4]。因此，針對不同的細胞類型，選擇適合的轉染試劑對轉染效果具有決定性影響。

物理法包括顯微注射法、電穿孔法等^[5]。其中，電穿孔方法是利用高壓電流脈沖在細胞膜上形成瞬時微孔，使核酸等生物分子進入細胞。該方法轉染效率高，但對細胞的損傷較大，細胞致死率高。

病毒載體法，如慢病毒、腺病毒和逆轉錄病毒。尤其是，慢病毒和逆轉錄病毒可以將基因組整合到宿主細胞中，實現穩定且長期的基因表達^[6]。然而，病毒載體法存在細胞毒性和潛在的生物安全風險，需要嚴格的操作規范。

02#

細胞密度是影響轉染效率的重要因素之一。

一般來說，貼壁細胞在70%-90%匯合度時轉染效果較好。然而，對于某些特殊的細胞系或轉染方法，可能需要調整細胞密度。建議在轉染前一天設置多個細胞密度梯度進行接種，以便在轉染細胞時達到不同的匯合度。轉染后，通過實驗評估各組的轉染效率和細胞狀態，以確定細胞密度范圍。

03#

以脂質體轉染為例，脂質體轉染試劑和待轉物的比例不同，對轉染效率和細胞毒性有顯著影響。

為了優化轉染效果，建議在細胞消化接種到孔板時，每孔加入等量的細胞懸液，以確保轉染時細胞密度的一致性。根據轉染試劑說明書推薦比例，設置梯度，如轉染試劑：待轉物比例分別為1:1、2:1、3:1，制備不同濃度的轉染復合物，分別加入到相應的孔中，每個比例設置3個重復孔以確保數據的可靠性。將培養板置于細胞培養箱中孵育一定時間后，通過熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測轉染效率，并用CCK-8法檢測細胞存活率。根據實驗結果，選擇轉染效率高且細胞毒性低的比例，用于后續實驗。

04#

轉染后細胞與轉染復合物的孵育時間是影響轉染效果的重要因素之一。

孵育時間過短可能導致轉染復合物未能充分進入細胞，導致轉染效率低；而孵育時間過長則可能增加轉染試劑對細胞的毒性，影響細胞狀態。為了優化轉染效果，建議在轉染后設置多個時間點（如6 h、12 h、24 h等）更換培養基，并觀察轉染效率和細胞毒性變化。對于一些對轉染試劑較為敏感的細胞，縮短孵育時間可能有助于降低細胞損傷，同時保持較高的轉染效率。通過實驗確定孵育時間，以實現轉染效果和細胞活性的平衡。在完成一系列優化實驗后，需對結果進行系統總結。對比不同條件下轉染效率和細胞存活率的數據，分析各參數對轉染效果的影響。根據實驗結果，總結出適用于特定細胞系或實驗體系的轉染條件優化策略，為后續實驗提供參考依據。

圖2. 用EGFP表達質粒轉染Hep G2細胞48 小時后的熒光蛋白表達效果（A：白光圖，B：熒光圖，C：流式檢測轉染效率）

細胞狀態是影響轉染效率的關鍵因素之一。應確保使用處于對數生長期且活力良好的細胞，避免使用傳代次數過多或受污染的細胞。

核酸的質量和純度對轉染效果至關重要，應使用無內毒素的高純度核酸。

在優化轉染條件時，建議設置空載體對照、未轉染組及陽性對照組，以排除干擾因素，確保實驗結果的可靠性。

不同細胞類型對轉染方法和條件的要求不同，需根據具體細胞類型和實驗目的進行調整。